什么是PCR检测
他的原理是什么
需要什么材料
PCR技术是一种用大扩增特定的DNA片段的分子生技术，它可看作物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
我们实验室用BIODAI测得的扩增曲线起跳值一般在30左右，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
基因诊断的基本原理
基因诊断又称DNA诊断或分子诊断，通过分子生物学和分子遗传学的技术，直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常，从而对疾病做出判断。
核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一。
基因诊断技术它的基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。
这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行。
因此，当用一段已知基因的核酸序列作出探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。
由此可见，进行基因检测有两个必要条件，一是必需的特异的DNA探针；二是必需的基因组DNA。
当两者都变性呈单链状态时，就能进行分子杂交。
一、基因探针基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是\\\/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。
1．探针的来源 DNA探针根据其来源有3种：一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针（genomic probe）；另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNa 探针（cDNa probe）。
与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列。
此外，还可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。
基因诊断2．探针的制备 进行分子突变需要大量的探针拷贝，后者一般是通过分子克隆（molecular cloning）获得的。
克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。
当制备基因组DNA探针进，应先制备基因组文库，即把基因组DNA打断，或用限制性酶作不完全水解，得到许多大小不等的随机片段，将这些片段体外重组到运载体（噬菌体、质粒等）中去，再将后者转染适当的宿主细胞如大肠肝菌，这时在固体培养基上可以得到许多携带有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通过原位杂交，从中可筛出含有目的基因片段的克隆，然后通过细胞扩增，制备出大量的探针。
为了制备cDNA 探针，首先需分离纯化相应mRNA，这从含有大量mRNA的组织、细胞中比较容易做到，如从造血细胞中制备α或β珠蛋白mRNA。
有了mRNA作模板后，在逆转录酶的作用下，就可以合成与之互补的DNA(即cDNA)，cDNA与待测基因的编码区有完全相同的碱基顺序，但内含子已在加工过程中切除。
寡核苷酸探针是人工合成的，与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个核苷酸的片段。
如仅知蛋白质的氨基酸顺序量，也可以按氨基酸的密码推导出核苷酸序列，并用化学方法合成。
3.探针的标记 为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号,通常采用放射性同位素32P标记探针的某种核苷酸α磷酸基。
但近年来已发展了一些用非同位素如生物素、地高辛配体等作为标记物的方法。
但都不及同位素敏感。
非同位素标记的优点是保存时间较长,而且避免了同位素的污染。
最常用的探针标记法是缺口平移法(nicktranslation)。
探针的标记也可以采用随机引物法，即向变性的探针溶液加入6个核苷酸的随机DNA小片段，作为引物，当后者与单链DNA互补结合后，按碱基互补原则不断在其3’OH端添加同位素标记的单核苷酸，这样也可以获得比放射性很高的DNA探针。
二、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease），又简称限制酶或内切酶。
它们是基因工程和基因诊断重要的一类工具酶。
它们的发现和应用为从基因组中分离目的基因提供了必要的手段.限制酶能特异地识别和切割特异的核苷酸序列，将双链DNA切成较小的片段。
酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一DNA片段上，并被分离出来。
限制酶主要来源于原核生物，是一组能水解DNA磷酸二酯键的酶。
迄今已发现的限制酶多达数百种，分为三类。
在基因工程中使用的主要是第二类。
限制酶根据其来源命名。
每种限制酶识别和切割的通常为4-6个核苷酸序列，称为限制性位点(restriction sites)或切点。
限制酶切割双链DNA的方式有两种，产生的末端也有两种：第一种是交错切割，即两条链的切点不在同一水平而是相隔数个碱基，故断口产生两小段自身互补的单链，这种末端容易互补连接，称为粘性末端（cohesive terminus）；第二种为平整切割。
限制酶的上述特性在基因工程和基因诊断中具有重要用途：①首先不论DNA的来源如何，用同一种内切酶切割后产生的粘性末端很容易重新连接，因此很容易将人和细菌或人和质粒任何两个DNA片段连接在一起，即重新组合，这是重组DNA技术的基础。
②人类的基因组很大，不切割无法分析其中的基因。
限制酶能把基因组在特异的部位切开，即切割不是随机的，因而从每个细胞的基因组得到的是相同的一组长度各异的片段。
这些可能含有某一基因的片段可用电泳分离，并加以研究。
③由于限制酶的特异性，如果识别位点的碱基发生了改变，限制酶将不再能切割；同样，碱基的改变也可能导致出现新的酸切位点。
在人类基因组中，这两种情况是十分常见的，而切点的消失或出现将影响获得的DNA片段的长度，表现为限制性片段长度多态性（RFLP），这在基因的连锁诊断中具有极重要的意义。
三、限制性片段长度多态性一个人的两套单倍体DNA是不完全相同的，一般每100－500个碱基对就有一个是不相同的。
换言之，如果把两套基因组DNA（各3.2×109bp）排列起来，那么平均有1000万处不同，它们多位于内含子序列中。
实际上，除单卵双生子外，人群中没有两个个体的基因组DNA是完全相同的。
DNA的多态性虽可通过DNA测序检出，但用限制酶消化却是最常用的检测方法。
1．RFLP由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出现，从而引起不同个体在用同一限制酶切时，DNA片段长度出现差异，这种由于内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异，称为限制性片段长度多态性（restriction fragmentlength polymporphism, RFLP）。
RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性变异，它按照孟德尔方式遗传。
RFLP可用Southern印迹杂交法检出。
用Southern杂交检出RFLP时，如探针跨越切点，则被切开的两个片段均可与探针杂交，从而显示两条杂交带。
2．两点RFLP （1）点多态（point polymorphism）：是由于单个或少数碱基的改变引起酶切点的出现或消失所致的RFLP。
上述的RFLP即属于这一类。
它们属经典的RFLP。
在人类基因组中已发现数以百计的此类多态位点。
（2）数目变异的串连重复（variable number tandem repeats,VNTR）：上述经典的单个碱基取代所致的RFLP一般只能检测到一种杂合性的两种形式，即“有”或“无”某个限制酶切位点，而且每个位点在人群中的杂合子频率通常不会超过50%，当被测个体为纯合状态时，利用RFLP就无法得到所需要的多态信息。
此外，在整个基因组中，这类RFLP目前发现的数量还有限，并分布不匀。
但是，在人类基因组中还存在一类DNA重复序列，称为小卫星DNA。
它们分布十分广泛，每一个单位通常只有16-28bp长，但其重复次数在人群中是高度变异的。
当用限制酶切割VNTR区时，只要酶切点不在重复区内，就可能得到各种长度不同的片段与小卫星DNA不同，另一类重复序列是卫星DNA。
它们的基本序列有1－6bp，如（TA）n、(CGG)n等，通常重复10－60次并呈高度的多态性。
VNTR具有高度的变异性，同时也是按照孟德尔方式遗传的，因此是很好的遗传标记，由于它们类型众多和在基因组中分布广泛，因而在基因连锁诊断中应用日益广泛。
青霉素的抗菌机制是什么
青霉素作制是干扰细菌细胞壁的。
青霉素通过抑制细胞壁四肽侧链和五连桥的结合而阻碍细胞壁合成而发挥杀菌作用。
青霉素的结构与细胞壁的成分粘肽结构中的D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍粘肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。
通常情况下，主动运输，协助扩散和自由扩散的速率大小比较
通常情况下，协助扩散速率最快，其次是自由扩散。
协助扩散的运输特点是： ①比自由扩散转运速率高； ②存在最大转运速率； 在一定限度内运输速率同物质浓度成正比。
如超过一定限度，浓度再增加，运输也不再增加。
因膜上载体蛋白的结合位点已达饱和； ③有特异性，即与特定溶质结合。
这类特殊的载体蛋白主要有离子载体和通道蛋白两种类型。
dna转录 翻译的具体过程
DNA转录翻译到蛋白质的详细过程第一步：DNA双链解开,DNA双链的碱基得以暴露第二步：游离的核糖核苷酸随机地与DNA的碱基互补时,两者以氢键结合第三步：新结合的核糖核苷酸连接到正在合成的mRNA分子上第四步：合成的mRNA从DNA链上释放.而后,DNA双链恢复第五步：mRNA进入细胞质,与核糖体结合.携带甲硫氨酸的tRNA,通过与碱基AUG互补配,进入位点1.第六步：携带组氨酸的tRNA以同样的方式进入位点2第七步：甲硫氨酸通过与组氨酸形成肽键而转移到占据位点2的tRNA上第八步：核糖体读取下一个密码子,原占据位点1的tRNA离开核糖体,占据位点2的tRNA进入位点1,一个新的携带氨基酸的tRNA进入位点2,继续肽链的合成.重复步骤五、六、七,直到核糖体读取到mRNA的终止密码.
肺癌的突变基因有哪些
1、EGFR靶点EGFR基因突变在肺腺癌里频率较高，非亚裔的频率是10-20%，而亚裔非吸烟患者的频率在40%左右，也有文献统计说50%，这也是为何很多患者盲试易瑞沙和特罗凯也有效的原因，频率几乎一半。
EGFR基因在鳞状细胞癌里偶尔出现，没有特别高的频率，因此鳞癌患者谨慎盲试EGFR靶点的靶向药物，最好做基因检测确定突变情况。
EGFR基因90%以上的突变发生在19号外显子缺失和21号外显子的L858R。
这两种突变位点适用于第一代EGFR靶向药物吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼。
19外显子缺失和L858R突变之外的称之为罕见突变，如L861Q，G719X，S768I等，这些突变位点适合使用第二代靶向药物阿法替尼，即不可逆的EGFR和HER2双重抑制剂。
虽然有临床研究表明，阿法替尼相比吉非替尼可改善PFS和客观响应率，但是副作用较大，目前阿法替尼优势还是在EGFR的罕见突变位点，或Her2突变导致的耐药。
一般而言靶向药物总是存在耐药的问题，一代EGFR靶点药物耐药的主要原因是EGFR基因的二次突变，即产生了T790M突变，频率为50-65%，存在T790M突变的患者适用的靶向药物是奥希替尼（AZD9291），临床阶段的靶向药物还有Rociletinib（CO-1686）。
当然奥希替尼也会耐药，耐药的原因可能是EGFR基因的C797S突变，或者Her2，或者c-MET扩增等。
C797S突变如果和T790M突变在同一条染色体则称为顺势构型，目前没有靶向药物，如果C797S和T790M在不同的染色体上，即反式构型，则可以使用一代和三代靶向药物联合来治疗。
存在脑转移的EGFR患者，现有的研究表明如果可以使用靶向药物控制就不进行放疗，全脑放疗仅有一次机会。
如果病灶数目小且不超过3个，不能靶向控制，就使用伽马刀。
入脑效果较好的靶向药物有特罗凯，达克替尼（PF299804）、AZD3759，AZD9291等。
癌度提醒您，需注意的是临床阶段的AZD3759不具有T790M靶点，存在T790M突变的脑转患者建议选择AZD9291。
2、ALK融合ALK融合基因发现于2007年，后续一系列对应的靶向药物相继出现，目前ALK的靶向药物也有3代了。
最常见于ALK基因的20号外显子与EML4发生融合，其他的融合伴侣基因还有KIF5B、TFG和KLC1等，目前发现有27种融合形式，因此检测时需确保这些融合位点都做了详细的覆盖，避免漏检。
ALK在非小细胞肺癌的突变频率为2-7%，年轻非吸烟的患者较易出现该基因突变。
ALK基因的检测方法有FISH、免疫组化（IHC）、测序等。
一般而言是与其他驱动基因互相排斥。
ALK突变的第一代靶向药物是克唑替尼，2011年获批上市，克唑替尼具有ALK、ROS1和C-MET三个靶点。
存在ALK突变的患者使用克唑替尼的中位PFS约为9.7个月。
克唑替尼耐药后可以使用第二代ALK抑制剂，主要有色瑞替尼（LDK378）、艾乐替尼（CH5424802）、Brigatinib（AP26113）和X-396，其中色瑞替尼和艾乐替尼已经获批上市。
这些二代ALK抑制剂都有相应的临床试验，不同的二代ALK抑制剂对不同的ALK耐药位点起作用，因此克唑替尼耐药后，较为灵敏地检测出ALK是什么耐药位点，对于选择恰当的二代ALK抑制剂非常有益，由于组织样本难以获取，因此如果对血液样本使用数字PCR检测ALK常见的这些耐药位点，将使得很多患者受益，再次呼吁基因检测公司引起重视，早日开发。
ALK的第三代靶向药物是PF-06463922，该药几乎可以抑制导致克唑替尼耐药的所有耐药位点，靶向ALK和ROS1。
最新的研究发现ALK的L1198F突变也导致PF-06463922耐药，但是这一耐药位点可以重新用回第一代克唑替尼。
入脑能力上，艾乐替尼的入脑效果较强，研究显示PF-06463922和克唑替尼也具有入脑能力。
3、ROS1基因ROS1基因的突变形式也是融合，在非小细胞肺癌中的突变频率为1-2%，多见于肺腺癌，目前鉴定出9种融合突变形式。
ROS1基因检测的金标准是FISH，其他检测技术有免疫组化、二代测序等。
存在ROS1突变的患者一般较为年轻。
ROS1的获批靶向药物为克唑替尼，之前经过化疗治疗的患者使用克唑替尼，72%的患者响应，中位PFS为19.2个月。
ROS1突变的患者克唑替尼也会耐药，耐药的形式主要是激酶区域的二次突变（CD74-ROS1的G2032R），其他的耐药情况有旁路激活，如c-KIT或KRAS基因突变，目前正在研究的其他ROS1靶向药物包含色瑞替尼、卡博替尼、PF06463922。
癌度需要提醒的是ROS1的靶向药物与ALK的靶向药物不是完全重合的，比如艾乐替尼对ROS1的效果就不理想，因此任何时候请参考数据，慎之又慎。
4、RET融合RET基因融合在非小细胞肺癌的突变频率为1-2%，非吸烟的肺腺癌和鳞癌里都可能存在RET基因融合突变。
RET基因的检测技术与ALK和ROS1的一样，都是FISH、免疫组化和测序等。
多种靶向药物显示对RET基因具有控制作用，如舒尼替尼、索拉菲尼、凡德他尼、卡博替尼、艾乐替尼、阿帕替尼、乐伐替尼和帕纳替尼等，以上靶向药物多数处于临床试验阶段，比较确定的是凡德他尼和卡博替尼。
有关RET的靶向药物和相应的临床数据详情请见癌度的RET专贴。
5、c-MET扩增或14外显子跳跃突变c-MET扩增在肺腺癌的频率为4%，在肺鳞状细胞癌的频率为1%。
C-MET如果扩增倍数较高（MET:CEP7比例大于5）可能对MET抑制剂有较好的响应率，如卡博替尼、克唑替尼和INC280（Capmatinib）等。
另外最近发现的c-MET基因的14号外显子跳跃式突变也是一个驱动突变，14外显子跳跃式突变在肺腺癌的频率为3-4%，患者使用克唑替尼或卡博替尼也可以获益。
6、HER2扩增35%的肺癌存在HER2蛋白过表达，HER2基因水平的扩增频率约为10%，HER2突变在非小细胞肺腺癌的频率约为2%，主要突变形式是20外显子插入突变，女性、非吸烟患者较为常见。
目前没有大样本的数据确切地表明HER2过表达在肺癌里可以应用曲妥珠单抗获益，虽然曲妥珠单抗在乳腺癌、胃食管结合部癌有效，但不是所有肿瘤都可以照搬，有一定组织器官的因素影响其有效性。
一项临床II期试验表明达克替尼（PF299804）客观响应率在12%左右。
需要注意的是达克替尼具有EGFR和HER2两个靶点，入脑效果很好。
其他临床阶段的靶向药物还有曲妥珠单抗、T-DM1。
7、BRAF突变肺癌里BRAF基因突变频率为3-5%，在吸烟的肺腺癌里较为常见。
肺腺癌里BRAF基因V600E占了50%左右。
存在BRAF基因突变的肺癌患者对维罗非尼、达拉非尼等靶向药物敏感，客观响应率为42%，中位PFS为7.2个月。
在黑色素瘤里观察到联合使用达拉非尼和曲美替尼可以获得较高的客观响应率（63%）。
癌度之前报道了肠癌患者联合使用BRAF抑制剂和PI3K信号通路的mTOR抑制剂，有效率也更高。
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8、KRAS突变KRAS突变在肺癌里非常常见，12号密码子突变频率大于90%，13号密码子频率低于10%。
肺腺癌里的KRAS突变频率约为25%，鳞癌里KRAS基因突变频率为5%，在长期吸烟的非亚裔患者里，KRAS突变频率更加的高。
直接针对KRAS突变的靶向药物目前还没有，思路是打击KRAS基因下游的MEK靶点，目前的药物有曲美替尼、司美替尼、MEK162、bemaciclib，索拉菲尼和索坦也有MEK靶点。
不过目前看来这些靶向药物和化疗联用可能获益更大一些。
9、PIK3CA突变PIK3CA的突变频率也不是特别高，但是该基因发生激活突变，会导致mTOR信号通路上调，一般使用mTOR抑制剂如依维莫司、雷帕霉素等。
针对PIK3CA的处在临床阶段的靶向药物有LY3023414（临床II期），PQR309（临床I期）。
PI3K信号通路里的PTEN、NF1基因等如果发生了失活突变，也可以使用mTOR抑制剂，有关该基因及相关信号通路的内容，请关注“癌度”微信号查阅。
10、NTRK1和NTRK2重排NTRK1和NTRK2基因重排在非小细胞肺癌的频率约为1-2%，重排突变的检测技术是FISH、免疫组化和二代测序。
目前有一些NTRK抑制剂处于研发之中。
这些药物分别是Entrectinib（临床II期）、LOXO-101（临床II期）、卡博替尼（临床II期）和DS-6501b（临床I期）。
11、肺鳞状细胞癌的基因突变癌症基因组图谱的一项研究表明，96%的肺鳞癌患者存在基因突变（检测样本数178例），包含FGFR扩增，PI3K信号通路的基因突变、DDR2、EGFR和HER2的突变等，另外肿瘤抑癌基因TP53和P16突变也常见。
肺鳞癌里FGFR扩增的频率为5-22%，DDR2突变的频率为4%，目前有相应的靶向药物抑制这两个基因突变的临床试验开展，但无确切数据表明有较好获益。
12、小细胞肺癌的治疗小细胞肺癌里几乎都存在TP53基因和RB1基因的失活突变，有时还有基因组水平复杂的重排。
四分之一的患者在NOTCH基因家族也有失活突变。
与其他肺癌亚型不同，最近25年里，小细胞肺癌的靶向治疗没有什么突破。
唯一批准用于二线的药物是托泊替康。
小细胞肺癌通常对化疗敏感，但很多时候快速地发展出抗药性。
因此多数患者使用依托泊苷（在日本使用伊立替康替代依托泊苷）联合顺铂或卡铂的双药化疗。
13、抗VEGF靶向药物抗VEGF的靶向药物比较适合于化疗联合，但是需要谨记的是局限于肺腺癌，而且没有咯血风险的患者。
雷莫芦单抗已经获批与多西他赛联合用于非小细胞肺腺癌。
另一种靶向药物尼达尼布获得EMA批准，与多西他赛联合治疗肺腺癌患者，但是FDA没有批准尼达尼布。
14、EGFR抗体Necitumumab是一种单克隆抗体，靶向于EGFR，Necitumumab与顺铂、吉西他滨联合使用，可以改善晚期鳞状细胞癌患者的生存获益。
该药已经被美国FDA批准，但是欧洲EMA仅限该药用于存在EGFR过量表达的患者。
15、免疫治疗肿瘤的进展不只是基因突变的事情，与肿瘤细胞的环境也有关系，尤其是免疫环境。
最近靶向免疫检查点的靶向药物PD1可谓红遍了天。
几个进入临床应用或即将进入临床的单克隆抗体药物如下。
直接靶向PD-1的药物有纳武单抗（Opdivo，nivolumab），派姆单抗（Keytruda，pembrolizumab）。
靶向PD-L1的药物有，atezolizumab, durvalumab, avelumab。
PD1药物对肺癌患者的生存获益改善非常好，一项包含129例患者的纳武单抗治疗的非小细胞肺癌试验表明，2年生存率为24%。
吸烟的患者和PD-L1表达阳性的患者效果较好。
目前PD1药物的使用是二线用药，纳武单抗、派姆单抗都已经获批用于非小细胞肺鳞癌。
对于存在PD-L1阳性的非鳞状细胞癌也有推荐使用。
但是PD-L1表达不是评估是否能用PD1的标志物，因为PD-L1阳性的患者也有无效的，PD-L1阴性的患者也有有效的，而且PD-L1的检测由于不同机构使用不同的抗体、检测技术不同也有差异。
对于未经过任何治疗的患者，使用PD-1或PD-L1靶向药物，一年生存率超过了70%，这是非常好的数据。
以上数据源自最近的几个大型临床试验，对照为化疗药物多西他赛。
可以看到对肺癌患者来说，PD-L1阳性意味着较高的有效率，但PD-L1阴性也是有效的，不是完全不能用。
其实很多时候如果患者已经没有其他的靶向治疗措施了，想试试PD1药物时，做PD-L1表达的检测似乎没有太大必要，因为阴性表达也不是说完全无效，还是可以试试的。
16、晚期非小细胞肺癌的维持治疗维持治疗分为继续维持治疗和换药维持治疗，培美曲塞是一种既可用于换药维持治疗，也可用于继续维持治疗的化疗药物。
另外厄洛替尼也是一种维持治疗的选择。
一般而言4-6个周期的化疗，然后观察，成为了进展期非小细胞肺癌的一线治疗方案。
对于存在EGFR或ALK等其他靶向药物抑制的患者，持续服用靶向药物是维持治疗效果必须的。
如果存在耐药的症状，需结合CT病灶变化，以及其他的症状考虑重新活检，进行基因检测，查询耐药原因，更换药物进行治疗。
